La collection de tableaux commencée par les Médicis, continuée ensuite par les Habsbourg-Lorraine compte une grande quantité de chefs-d'œuvre.

Parmi les œuvres les plus importantes, distribuées dans les magnifiques salles, rappelons celles de Giotto et de son maître Cimabue, de Simone Martini, de Paolo Uccello, de Piero della Francesca, de Botticelli, de Léonard, de Michel Ange, de Raphaël, du Titien, de Correggio, de Veronese, de , de Rubens et de Rembrandt.
Parmi les salles, très suggestive est la salle octogonale, dite de la Tribune, qui a la voûte recouverte de coquilles de nacre.