La raccolta di pittura iniziata dalla famiglia Medici, proseguita poi dagli Asburgo-Lorena, annovera capolavori su capolavori.

Tra le opere più importanti, distribuite nelle magnifiche sale, ricordiamo quelle di Giotto e del suo maestro Cimabue, di Simone Martini, di Paolo Uccello, di , del Botticelli, di Leonardo, di Michelangelo, di Raffaello, di Tiziano, del Correggio, del Veronese, del Caravaggio, di Rubens e di Rembrandt. Tra le sale, molto suggestiva è quella ottagonale, detta la Tribuna, che ha la volta ricoperta con gusci di madreperla.